ทะลุกรอบ

ป๋วย อุ่นใจ

 

แรปิดเทสต์โควิด-19 แบบดูโอคริสเพอร์

ตรวจไว ไม่ต้องใช้พีซีอาร์

 

ในช่วงนี้ กระแส ATK (antigen test kit) หรือชุดตรวจแอนติเจนสำหรับโควิด-19 กำลังมาแรง หลายคนคงได้เริ่มลองจิ้มกันดูบ้างแล้ว

บางคนอาจจะสบายใจว่าตรวจแล้วผลไม่ติด และไม่มีอาการอะไร ก็คิดว่าคงไม่ติด (แต่ถ้าไปเสี่ยงมาก็ควรกักตัวอยู่ดี)

แต่บางคนยังแอบมีอาการวิตกจริต เพราะจิ้มไปแล้วแม้ว่าผลบอกไม่ติด แต่มีไข้รุมๆ แบบนี้ก็ยากจะมั่นใจได้ ยังไงก็อาจจะต้องรอตรวจอาร์ทีพีซีอาร์ (RT PCR) ซ้ำดูอีกรอบ ถ้าอยากให้ชัวร์

บางคนตรวจ ATK ผลเป็นลบ แต่พอไปทำอาร์ทีพีซีอาร์ ผลดันออกมาเป็นบวกก็มี ก็อาจจะโทษได้ว่า ATK ไม่เวิร์ก แต่ในความเป็นจริงอาจจะจิ้มไม่โดน หรือตอนที่ตรวจ ไวรัสอาจจะยังน้อยเกินกว่าจะตรวจพบ ก็เป็นไปได้หมด

ดังนั้น อย่าไปยึดมั่นถือมั่นกับผลตรวจ ATK จนไม่เป็นอันทำอะไร เพราะทุกอย่างผิดพลาดได้

ขนาดตรวจอาร์ทีพีซีอาร์ บางทีเทคนิเชียนที่ตรวจมึนแปะฉลากสลับหลอด จนกักตัวผิดคนก็เคยมีให้เห็นมาแล้วในต่างประเทศ สี่เท้ายังรู้พลาด นักปราชญ์ยังรู้พลั้ง ของแบบนี้ ทุกอย่างเกิดขึ้นได้เสมอ

แต่หวังว่าจะไม่เกิดบ่อย เพราะถ้ากักผิดคน ความเสียหายที่ตามมาอาจจะสาหัส

และนั่นทำให้แพทย์หลายๆ คนไม่สนับสนุนให้คนทั่วไปเอาชุดตรวจ ATK มาใช้ตรวจกันเอง เพราะว่าไม่มั่นใจในคนใช้ กลัวผลลบปลอม (false negative) บ้าง ผลบวกปลอม (false positive) บ้าง อาจจะทำให้วุ่นวาย

ผลบวกปลอม (ผลเป็นบวกแม้จะไม่ติด) ไม่ค่อยน่ากลัว เพราะถ้าผลเป็นบวก ส่วนใหญ่คนจะตกใจและกักตัว หรืออย่างน้อยก็น่าจะพยายามหาทางตรวจอาร์ทีพีซีอาร์ซ้ำ

แต่ถ้าลบปลอม (ผลเป็นลบแต่ที่จริงแล้วติด) แล้วเจอพวกที่ไม่ใส่ใจความปลอดภัยของสังคม เป็นลบปุ๊บ ตะลอน ตะลอนไปทั่วอย่างชะล่าใจ แบบนี้ไม่ไหว เพราะอาจจะเกิดคลัสเตอร์ใหม่ขึ้นมาได้ง่ายๆ

ที่กล่าวมาทั้งหมดนี้ ไม่ได้หมายความว่ารัฐไม่ควรอนุมัติให้คนสามารถใช้ ATK มาตรวจกันเอง แต่ควรสนับสนุน เพราะยิ่งมีคนใช้เยอะขึ้น ความคล่องในการจิ้ม (อาจจะบวกกับความชินชาภายในจมูก ที่โดนจิ้มจนพรุน) ก็น่าจะเพิ่มสูงขึ้น และเป็นไปได้ว่าผลตรวจก็จะค่อยๆ แม่นยำเพิ่มมากขึ้นตามไปด้วย

ดังนั้น สำหรับผู้บริหาร เรื่องจำเป็นเร่งด่วนที่ควรทำคือการเอื้ออำนวยให้ประชาชนคนทั่วไปสามารถเข้าถึงชุดตรวจได้อย่างเท่าเทียม

อยากบอกว่า ในหลายประเทศที่พัฒนาแล้ว การหาชุดตรวจโควิด-19 อาจจะหาได้ง่ายพอๆ กับการหาห้องสุขา!

แต่ที่สำคัญที่สุดจริงๆ คือการแก้ปัญหาวิกฤตศรัทธา รัฐเองต้องหาวิธีสื่อสารกับมวลชน อธิบายแนวทางการเลือกชุดตรวจที่เหมาะสมกับการเอามาตรวจด้วยตนเองที่บ้าน (ว่าจะตรวจจากน้ำลาย แค่ถูๆ ในปาก ในคอ ตอนเช้าหลังตื่นนอน หรือสวอปในรูจมูกแบบเบาๆ หรือจะจิ้มเอาจากโพรงจมูกให้สุดไม้ อาจจะให้ความรู้สึกแบบโหดร้ายและแสบจมูกได้ไปอีกหลายชั่วโมง)

ขั้นตอนกระบวนการตรวจวินิจฉัยโรค (จะสวอปกี่วินาทีในปาก หรือในจมูก สวอปแล้วทำอะไรต่อ) รวมไปถึงการอ่านผลให้กระจ่างอย่างเข้าใจ (แถบขึ้นกี่แถบ แต่ละแถบแปลว่าอะไร ผลเชื่อถือได้มากแค่ไหน) เพื่อให้ทุกคนสามารถตรวจกันเองได้ โดยไม่ต้องพึ่งหมอ

หลายคนอาจจะบอกว่าอ่านเอาจากฉลากข้างกล่องก็ได้ อย่าลืมว่าสำหรับบางคนอาจจะง่าย แต่อาจจะไม่ได้ง่ายสำหรับทุกคน

ดังนั้น การบ้านของทางภาครัฐจึงอยู่ตรงนี้ เพื่อช่วยเพิ่มโอกาสในการตรวจหาการระบาด และลดโอกาสในการผิดพลาด จนมีผู้ติดเชื้อเล็ดลอดสายตาไปปูดคลัสเตอร์ใหม่ขึ้นมา

การตรวจแอนติเจนคือการตรวจหาโปรตีนของไวรัส โดยใช้แอนติบอดี้ที่จำเพาะกับไวรัสโควิด-19 มาเป็นตัวตรวจจับโปรตีนของไวรัส ถ้ามีไวรัส แอนติบอดี้ที่จำเพาะก็จะจับกับไวรัส สัญญาณจะขึ้นเห็นเป็นแถบสีชัดในเส้นเทสต์ (test line, T) ส่วนในเส้นคอนโทรล (control line, C) นั้นยังไงก็ต้องขึ้น เพราะถ้าไม่ขึ้นแสดงว่าชุดตรวจพังไปแล้ว

การจิ้มให้ติดเอาสารคัดหลั่งที่มีไวรัสติดมาด้วยนั้นสำคัญมาก เพราะถ้ามีไวรัสติดมาน้อย ชุดตรวจ ATK ก็อาจจะมีความไว (sensitivity) ไม่พอที่จะตรวจพบ และให้ผลเป็นลบปลอมได้ ซึ่งน่ากลัวมาก

ปัญหานี้ก็เกิดเช่นเดียวกันกับการตรวจแบบอาร์ทีพีซีอาร์ คือถ้าจิ้มมาไม่โดนเชื้อเยอะพอ ผลอาจจะไม่ขึ้นเป็นบวกได้ แม้จะติดเชื้อก็ตาม

แต่ถ้าเทียบกับการตรวจอาร์ทีพีซีอาร์ก็ยังมีความไวในการตรวจหาเชื้อมากกว่า ATK อยู่มากพอตัว

และถ้าตรวจพบเชื้อยังสามารถประมาณได้ด้วยว่ามีเชื้อมากน้อยแค่ไหน เนื่องจากเทคนิคพีซีอาร์คือการทำปฏิกิริยาเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมในหลอดทดลอง (amplification)

ซึ่งปฏิกิริยาเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมนี้จะทำเป็นรอบๆ (cycle) ในแต่ละรอบ ก็จะมีการปรับเปลี่ยนอุณหภูมิขึ้นๆ ลงๆ เป็นวัฏจักร เพื่อให้กระบวนการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมนั้นทำได้อย่างสมบูรณ์

โดยทั่วไปแล้ว ช่วงแรก อุณหภูมิจะถูกปรับขึ้นไปอยู่ที่ประมาณ 95 องศาเซลเซียส เพื่อแยกสายดีเอ็นเอต้นแบบจากสายคู่เป็นสายเดี่ยว แล้วปรับลดลงมาเหลือ 50 องศาเซลเซียสเพื่อให้ไพรเมอร์ (สายดีเอ็นเอสังเคราะห์สั้นๆ ที่มีลำดับตรงกับสารพันธุกรรมที่สนใจ เช่น สารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรค) เข้าจับกับสายดีเอ็นเอต้นแบบ อุณหภูมิจะถูกปรับขึ้นอีกรอบไปอยู่ที่ราวๆ 70 องศาเซลเซียสเพื่อให้เอนไซม์ที่ชื่อว่าดีเอ็นเอพอลิเมอเรสสามารถช่วยเร่งปฏิกิริยาจำลองแบบดีเอ็นเอจนเสร็จ

หลังจากเสร็จสิ้นหนึ่งรอบของพีซีอาร์ ยีนของเชื้อไวรัส SARS-CoV-2 ก็จะถูกเพิ่มปริมาณขึ้นไปหนึ่งเท่าตัว ถ้ามีสารพันธุกรรมของเชื้อเยอะคือเชื้อที่จิ้มมามีเยอะ จำนวนรอบที่จะต้องใช้เพื่อเพิ่มจำนวนให้เห็นผลเป็นบวกก็จะน้อย แต่ถ้ามีเชื้อน้อย จำนวนรอบที่ต้องใช้ในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมก็ต้องใช้เยอะขึ้นตามลำดับ

เวลาตรวจแบบอาร์ทีพีซีอาร์ มักจะรายงานผลจำนวนรอบให้ดูต่างหน้าไว้ด้วย เป็นตัวเลข Ct หรือ cycle threshold ถ้า Ct เท่ากับ 15 นั่นคือเชื้อมีเยอะมาก เพิ่มจำนวนแค่ 15 รอบ ทุกรอบคือ 2 เท่าก็คือ 2 ยกกำลัง 15 ก็คือต้องเพิ่มไปราวๆ 3 หมื่นเท่าของสารพันธุกรรมที่มีจริงในตัวอย่าง ก็สามารถเห็นได้แล้วว่ามีเชื้ออยู่

แต่ถ้ามีเชื้อน้อย อาจจะมี Ct เท่ากับ 30 นั่นคือต้องเพิ่มจำนวนถึง 30 รอบ หรือเพิ่มไป 2 ยกกำลัง 30 เท่านั้น คือราวๆ พันล้านเท่าของสารพันธุกรรมที่พบจริงในตัวอย่าง จึงจะเห็นได้ว่ามีเชื้ออยู่

เทคนิคอาร์ทีพีซีอาร์นี้ มีความไวสูงมาก สูงขนาดที่ว่ามีแค่เพียงอาร์เอ็นเอของไวรัสเพียงแค่สายเดียวต่อไมโครลิตรของตัวอย่างก็สามารถตรวจพบได้

แต่ปัญหาของเทคนิคอาร์ทีพีซีอาร์คือต้องใช้เครื่องมือราคาแพง และใช้เวลาตรวจวินิจฉัยค่อนข้างนานอาจจะเป็นวัน ซึ่งไม่ตอบโจทย์สำหรับเอามาใช้เพื่อวินิจฉัยในภาคสนาม

 

“สำหรับการประยุกต์ใช้แบบพอยต์ออฟแคร์ (point of care) หรือในภาคสนาม คุณต้องการการรายงานผลที่เร็วเพื่อที่ผู้คนจะได้รู้ได้อย่างรวดเร็วว่าพวกเขาติดเชื้อหรือไม่ ก่อนที่คุณจะขึ้นเครื่อง หรือไปเยี่ยมญาติ” ทีน่า หลิว (Tina Liu) นักวิจัยจากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เบิร์กลีย์กล่าว

เทคโนโลยีอีกหลายแพลตฟอร์มจึงถูกพัฒนาขึ้นมาโดยใช้หลักการการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเช่นเดียวกันกับพีซีอาร์ แต่ให้เหมาะกับการใช้งานได้จริงในภาคสนาม

อย่างเช่น เทคนิคแลมป์ (LAMP) หรืออาร์พีเอ (RPA) ที่ปรับเปลี่ยนเอนไซม์จากพอลิเมอเรส (polymerase) ที่ใช้ในพีซีอาร์ มาใช้เอนไซม์พิเศษที่สามารถเร่งปฏิกิริยาแยกสายดีเอ็นเอและเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรคได้เองโดยไม่ต้องปรับเปลี่ยนอุณหภูมิขึ้นๆ ลงๆ เป็นวัฏจักรแบบพีซีอาร์ จึงไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือและอุปกรณ์ห้องทดลองราคาแพง อาจจะใช้แค่ถุงน้ำร้อนถุงเดียวก็เพียงพอแล้วที่เพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมในหลอดทดลองได้

การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมนั้นถือเป็นกุญแจสำคัญของการตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรค และช่วยเพิ่มความไวของชุดตรวจสารพันธุกรรมให้สูงกว่าแบบ ATK อย่างเห็นได้ชัด

เพราะแม้เชื้อจะมีอยู่เพียงน้อยนิด ถ้าเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมได้ ก็อาจจะตรวจเจอได้ แอนติเจนมีแค่ไหน ได้แค่นั้น เจอคือเจอ ไม่เจอคือจบ เพิ่มไม่ได้

ทว่า มีดีย่อมมีเสีย การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมแม้จะช่วยในการเพิ่มความไวในการตรวจจับเชื้อได้ แต่ก็อาจจะทำให้เกิดผลบวกปลอมได้เช่นกัน

“แต่คุณไม่จำเป็นต้องได้ความไวขนาดพีซีอาร์เพื่อที่จะจับและวินิจฉัยการระบาดของโควิด-19 ในชุมชน ถ้าชุดตรวจมันใช้ง่าย สะดวก และเร็วพอ” เดวิด ซาเวจ (David Savage) ศาสตราจารย์สาขาอณูชีววิทยาของเซลล์จากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย เบิร์กลีย์กล่าว

 

ด้วยความสนใจในการพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยแบบใหม่ เดวิดกับทีน่าจึงชักชวนทีมนักวิจัยระดับอเวนเจอร์ อย่างเจนนิเฟอร์ ดาอ์ดนา ที่เพิ่งตบเท้าเข้ารับรางวัลโนเบลปีที่แล้วมาหมาดๆ มาร่วมทีมโดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อออกแบบชุดตรวจสารพันธุกรรมแบบใหม่ที่สะดวก ว่องไว ไม่ต้องทำพีซีอาร์ ไม่ต้องเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรม พร้อมใช้ได้ทุกเมื่อ ทุกที่ ทุกเวลา

แนวคิดนี้เป็นเรื่องท้าทายและฉีกกฎการตรวจสารพันธุกรรมไปแบบไม่เหลือเค้าเดิม เพราะเดิมยังไงก็ต้องเพิ่มจำนวน แล้วถ้าไม่เพิ่มจำนวน มีอยู่นิดเดียว แล้วจะตรวจได้ยังไง?

เดวิดและทีมเลือกใช้เอนไซม์ Cas13 ที่ถูกโปรแกรมมาเพื่อให้จดจำอาร์เอ็นเอของไวรัสโควิด-19

เอนไซม์ Cas13 นอกจากจะตัดอาร์เอ็นเอของโควิดที่มันจำได้แล้ว ถ้าถูกกระตุ้นด้วยอาร์เอ็นเอที่เหมาะสม มันจะไล่ตัดสายอาร์เอ็นเออื่นๆ แบบบ้าระห่ำ (collateral cleavage) ซึ่งคุณสมบัตินี้ เฟิง จาง (Feng Zhang) นักชีววิทยาสังเคราะห์จากเอ็มไอทีเอามาใช้ในการออกแบบชุดตรวจ “เชอร์ล็อก (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING; SHERLOCK)” ที่โด่งดังไปรอบหนึ่งแล้วเมื่อปี 2017

ไอเดียคือใส่สายอาร์เอ็นเอสั้นๆ ที่ปลายข้างหนึ่งติดสีฟลูออเรสเซนต์ และอีกข้างหนึ่งติดตัวดูดสีฟลูออเรสเซนต์ (quencher) เอาไว้ในหลอดทดลองด้วย

ถ้าสีอยู่ใกล้กับตัวดูดสี จะไม่เห็นสีเรืองออกมา แต่ถ้า Cas13 เจออาร์เอ็นเอของเชื้อก่อโรค แล้วเกิดบ้าระห่ำ สายอาร์เอ็นเอติดสีนั้นก็จะถูกตัด สีจะหลุดออกจากตัวดูดสี และสามารถเรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ได้ ถ้าส่องไฟสีที่เหมาะสมเข้าไป

แม้ว่าจะฟังดูเพอร์เฟ็กต์ แต่ถ้าอาร์เอ็นเอของเชื้อก่อโรคมีน้อย Cas13 จะใช้เวลายาวนานมากอาจจะเป็นชั่วโมงกว่าที่จะให้สัญญาณเข้มพอจะตรวจวัดได้

 

ทีน่าตัดสินใจเลือกเอาเอนไซม์ในตระกูล Cas อีกชนิดที่มีชื่อว่า Csm6 ที่ทำงานแบบเดียวกับ Cas13 คือจะไล่ตัดโมเลกุลของอาร์เอ็นเอแบบบ้าระห่ำ แต่ Csm6 จะทำงานก็ต่อเมื่อเจอสายอาร์เอ็นเอที่เป็นวงเล็กๆ เท่านั้น ปัญหาคือถ้าใส่วงอาร์เอ็นเอนี้ ลงไป Csm6 จะเข้าไปจับแล้วเริ่มทำงานเลย ทางทีมวิจัยจึงออกแบบให้โมเลกุลของวงอาร์เอ็นเอที่จะกระตุ้น Csm6 เสียใหม่ให้มีส่วนของสายอาร์เอ็นเอมาปกป้องวงอาร์เอ็นเอเอาไว้

แต่เมื่อ Cas13 เจอสารพันธุกรรมของไวรัส สายอาร์เอ็นเอที่ปกป้องวงอาร์เอ็นเอจะโดนตัดปลดปล่อยวงอาร์เอ็นเอออกมาเป็นอิสระ เข้ากระตุ้นการทำงานของ Csm6 ได้

เอนไซม์ Csm6 ที่ถูกกระตุ้นจะตัดสายอาร์เอ็นเอได้อีกมากมาย ซึ่งไอเดียคือเติมสายอาร์เอ็นเอที่ปลายข้างหนึ่งติดกับสีฟลูออเรสเซนต์และอีกข้างติดกับตัวดูดสีแบบเดียวกันเลยกับเชอร์ล็อกให้ Csm6 ตัด ปรากฏว่าผลที่ได้น่าตื่นเต้นมากเพราะว่าผลการตรวจวินิจฉัยดีกว่าและไวกว่าแบบที่ใช้ Cas13 อย่างเดียวถึงร้อยเท่า

พวกเขาตั้งชื่อเทคนิคการตรวจวินิจฉัยโดยใช้เอนไซม์ในตระกูลคริสเพอร์สองตัว Cas13 และ Csm6 นี้ว่า FIND-IT (Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem)

เทคนิคนี้มีความไวสูงมากสามารถตรวจวัดสารพันธุกรรมของไวรัสได้แม้มีจำนวนไวรัสแค่เพียงราวๆ 30 เส้นต่อไมโครลิตร โดยใช้เวลาแค่ 20 นาที

แม้จะยังสู้ไม่ได้กับความไวที่แท้ทรูของอาร์ทีพีซีอาร์ที่เส้นเดียวก็ยังเจอ

แต่แค่นี้ก็หรูหราสุดๆ แล้วสำหรับแรปิดเทสต์ที่ไม่ต้องอาศัยการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรม

 

ในเวลานี้ พวกเขาได้พัฒนาการตรวจแบบนี้ให้อยู่ในชิพตรวจโรคเรียบร้อยแล้ว ส่วนวิธีการตรวจและรายงานผลก็ออกแบบมาเรียบร้อยแล้วเช่นกัน พวกเขาออกแบบเครื่องอ่านผลฟลูออเรสเซนต์ขนาดเล็กเอาไว้ด้วย เพื่อให้สะดวกต่อการพกพาไปใช้ได้ทันทีในภาคสนาม

“ความหวังของเราก็คือ อยากจะผลักดันชีวเคมีให้ไปให้ไกลที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ไปถึงจุดที่คุณจะจินตนาการได้ถึงชุดตรวจในรูปแบบที่สะดวกที่สุดแบบที่คุณสามารถจะเอามาใช้ตรวจได้ทุกวัน อย่างเช่น หน้าตึก ก่อนเข้าที่ทำงาน” เดวิดเผย

มหาวิกฤตโควิด-19 ทำให้เราได้เห็นบทบาทขององค์ความรู้ทางวิทยาศาสตร์ที่สำคัญยิ่งต่อการพัฒนาต่อยอดเทคโนโลยี นี่อาจจะเป็นอีกหนึ่งตัวอย่างเทคโนโลยีแห่งอนาคตที่เปลี่ยนมุมมองและแนวคิดของการออกแบบการตรวจวินิจฉัยโรคจากสารพันธุกรรมไปเลยก็เป็นได้